細(xì)胞內(nèi)的鈣稱為細(xì)胞內(nèi)鈣，可受到高度調(diào)節(jié)；這種緊密的調(diào)節(jié)使細(xì)胞內(nèi)鈣成為了解細(xì)胞功能和信號(hào)動(dòng)力學(xué)的較佳的工具，使其能夠在細(xì)胞遷移、交流和對(duì)刺激物或異物作出反應(yīng)的能力。

　　鈣：細(xì)胞過程的多功能指示劑

　　鈣信號(hào)可作為讀數(shù)來了解病毒在感染過程中利用宿主信號(hào)反應(yīng)的能力，并剖析所涉及的信號(hào)通路。有幾種細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光指示劑是可用于研究細(xì)胞功能；能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過程中的細(xì)胞反應(yīng)。為此可利用含有熒光鈣指示劑的細(xì)胞的活細(xì)胞成像，其中熒光的增加表明細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。

　　鈣指示劑的種類及其應(yīng)用

　　鈣指示劑主要分為兩大類：化學(xué)指示劑和基因編碼的鈣指示劑。可用于活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的鈣指示劑類型取決于預(yù)期的細(xì)胞系、成像長(zhǎng)度以及定性或定量數(shù)據(jù)的預(yù)期結(jié)果等因素。

　　1.預(yù)期細(xì)胞系：

　　對(duì)于原代細(xì)胞系直接的方法是使用熒光染料，將熒光鈣指示劑簡(jiǎn)單地添加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，并在孵育期后成像。

　　與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮、更穩(wěn)定。在活細(xì)胞成像中，熒光染料可以有效地進(jìn)行短期活細(xì)胞成像，但隨著時(shí)間的推移細(xì)胞有排出染料的趨勢(shì)。鈣染料的一個(gè)重要考慮因素是使用抑制劑還是激動(dòng)劑。抑制劑和激動(dòng)劑也可能影響鈣染料反映，類似于在天然組織中的表達(dá)。

　　在廣泛的鈣信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，已建立的細(xì)胞系是可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)遺傳編碼的鈣指示劑，如GCaMP、黃色cameleon等。對(duì)現(xiàn)有的不同基因編碼鈣指示劑進(jìn)行改進(jìn)，使指示劑更亮，光穩(wěn)定性更好，動(dòng)態(tài)范圍更大，從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞系中使用的一種較佳的工具，它將允許您選擇的指示劑在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。基因編碼報(bào)告系統(tǒng)的一個(gè)潛在問題是，并非所有細(xì)胞系都容易被轉(zhuǎn)導(dǎo)。　　

　　在用ADP 進(jìn)行激動(dòng)劑治療期間，人腸道類器官單層的實(shí)時(shí)、短期成像。這些有機(jī)體單層以綠色表達(dá)鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動(dòng)劑，用于在細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)。激動(dòng)劑治療是測(cè)試治療劑量反應(yīng)的較的好方法。

　　2.成像長(zhǎng)度

　　對(duì)于活細(xì)胞成像，時(shí)間長(zhǎng)度和間隔是需要記住的重要參數(shù)。細(xì)胞成像過程中的主要關(guān)注的是光漂白和光毒性。應(yīng)避免持續(xù)使用激發(fā)光，重要的是選擇足夠強(qiáng)的曝光時(shí)間和光功率，以檢測(cè)鈣信號(hào)，但不要過強(qiáng)，以免對(duì)細(xì)胞造成損害。成像的長(zhǎng)度將取決于實(shí)驗(yàn)。對(duì)于測(cè)試激動(dòng)劑或細(xì)胞反應(yīng)，這通常是5-20分鐘的較短成像運(yùn)行，每1-2秒捕獲一次圖像。對(duì)于研究傷口修復(fù)或病毒感染期間鈣信號(hào)傳導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，我們會(huì)在18-20小時(shí)內(nèi)成像，每分鐘捕捉一次圖像。　　

　　活細(xì)胞成像的技巧

　　考慮要使用的細(xì)胞系是很重要的。為了研究鈣動(dòng)力學(xué)，使用形成單層的細(xì)胞系將確保感興趣的區(qū)域保持聚焦，以捕捉信號(hào)動(dòng)力學(xué)，從而獲得較佳質(zhì)量的視頻和清晰的量化。對(duì)于涉及細(xì)胞間通訊和鈣動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞系融合也是一個(gè)重要的考慮因素。為了獲得質(zhì)量的圖像，選擇合適的載玻片非常重要。有些細(xì)胞培養(yǎng)物更喜歡玻璃載玻片而不是光學(xué)級(jí)塑料載玻片，因此最好測(cè)試腔室載玻片。我們的細(xì)胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片。　　

μ-Slide 8 Well high（貨號(hào)： 80806）

　　活細(xì)胞成像是使細(xì)胞的密度允許形成一個(gè)融合的單層，但不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度擁擠和團(tuán)塊。在成像過程中需要使用合適的培養(yǎng)基。許多傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)基含有酚紅，它可引起高背景熒光。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實(shí)信號(hào)。因此，重要的是用PBS洗滌細(xì)胞，并用無酚紅培養(yǎng)基或市售的用于活細(xì)胞成像的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基。